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ELISA的基本原理:
(1)抗原或抗体能以物理性地吸?#25509;?#22266;相载体表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附,并保?#21046;?#20813;疫学活性;
(2)抗原或抗体可通过共价键与酶连?#26377;?#25104;酶结合物,而此?#32622;?#32467;合物仍能保?#21046;?#20813;疫学和酶学活性;
(3)酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果。
    由于ELISA法一方面是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上,因而,具有特异性。而另一方面又由于酶标记抗原或抗体是酶分子与抗原或抗体分子的结合物,它可?#28304;?#21270;底物分子发生反应,产生放大作用,正因为此种放大作用而使本法具有很高的敏感性。因此,ELISA法是一种既敏感又特异的方法。
ELISA的操作要点:
    优质的试剂,良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果?#26082;?#21487;靠的必要条件。ELISA的操作因固相载体的形成不同而有所差异,国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式ELISA各个操作步骤的注意要点,珠式、管式及磁性球ELSIA,国外试剂均与特殊仪器配合应用,两者均有详细的使用说明,?#32454;?#36981;?#23637;?#23450;操作,必能得出?#26082;?#30340;结果。
    一、标?#38236;?#37319;取和保存
    可用作ELISA测定的标本十分广?#28023;?#20307;?#28023;?#22914;血清)、?#32622;?#29289;(唾?#28023;?#21644;?#21028;?#29289;(如尿液、粪便)等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定(如血清、尿?#28023;?#26377;些则需经预处理(如粪便和某些?#32622;?#29289;)。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外,其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂,而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后?#32431;?#21462;得。除特殊情况外,在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集,应注意避免溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP为标记的ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色。
血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久,其中的可发生聚合,在间接法ELISA中可使?#38236;?#21152;深。一般说来,在5天内测定的血清标本可放置于4℃,超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后,蛋?#23383;示?#37096;浓缩,分布不均,应充分混匀宜轻?#28023;?#36991;免气泡,可上下颠倒混和,不要在混匀器上强烈振?#30784;?#28151;浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤,澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落,所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测,宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作,也可加入适当防腐剂。
    二、试剂的准备
    按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水,包括用于洗涤的,应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。
    三、加样
    在ELISA中一般有3次加样步聚,即加标本,?#29992;?#32467;合物,加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产生气泡。加标本一般用微量加样器,按规定的量加入板?#23383;小?#27599;次加标本应更换吸嘴,以免发生交叉污染,也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定(如间接法ELISA)需用稀释的血清,可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板?#23383;?#21152;入稀释?#28023;?#20877;在其中加入血清标本,然后在微型震荡器上震荡1?#31181;?#20197;保证混和。?#29992;?#32467;合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器,使加液过程迅速完成。
    四、保温
在ELISA中一般有两次抗原抗体反应,即加标本?#22270;用?#32467;合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温?#32676;?#26102;间,这一保温过程称为温育(incubation),有人称之为孵育,在ELISA中似不恰当。
    ELISA属固相免疫测定,抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的?#34892;?#27861;为例,加入板?#23383;?#30340;标本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会,只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程,因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。
    温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃(冰箱温度)?#21462;?7℃是实验室中常用的保温温度,也是大多数抗原抗体结合的合适温?#21462;?#22312;建立ELISA方法作反应动力学研究时,实验表明,两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时,产物的生成可达顶峰。为加速反应,可提高反应的温度,有些试验在43℃进行,但不宜采用更高的温?#21462;?#25239;原抗体反应4℃更为彻底,在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜,?#23381;?#25104;最多的沉淀。但因所需时间太长,在ELISA中一般不予采用。
    保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外,一般均采用水浴,可将ELISA板置于水浴箱中,ELISA板?#23376;?#36148;着水面,使温度迅速平衡。为避免蒸发,板上应加盖,也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆?#21069;?#23380;,此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱,ELISA板应放在湿?#24515;冢?#28287;盒要选用传热性良好的材料如金属等,在盒底垫湿的?#24202;跡?#26368;后将ELISA板放在湿?#24202;?#19978;。湿盒应先放在保温箱?#24615;?#28201;至规定的温度,特别是在气温?#31995;?#30340;时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温育,反应板均不?#35828;?#25918;,以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应,操作时的室温应?#32454;?#38480;制在规定的范围内,标准室温温度是指20-25℃,但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时,ELISA板只要平置于操作台上?#32431;傘?#24212;注意温育的温?#32676;?#26102;间应按规定力求?#26082;貳?#20026;保证这一点,一个人操作时,一次不宜多于两块板同时测定。

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